Асноўныя парады па криоконсервации клеткавых культур

Асноўныя парады па криоконсервации клеткавых культур

Клеткі працягваюць свой метабалізм падчас звычайнай дзейнасці росту, што патрабуе ўдзелу розных пратэаз. Калі тэмпература апускаецца ніжэй -70 ° C, пратэазы перастаюць працаваць. Такім чынам, у асяроддзі з надзвычай нізкімі тэмпературамі клеткі могуць спыніць свае метабалічныя дзеянні і ўвайсці ў спакойны стан, які дазваляе доўгатэрміновае захоўванне.

1. Эксперыментальныя матэрыялы

Базавы матэрыял:

Асноўная культурная серада

Сыроватка (звычайны FBS/NBS)

Ультраабслугоўванне варштат

Стэрыльны диметилсульфоксид (DMSO)

Стэрыльны раствор солі PBS -фасфатнага буфера

Піпетынг пісталет

Электрычны піпецінг пісталет

Падрыхтоўка эксперыментаў

а) Падрыхтоўка рашэння для замарожвання:

Агульныя клеткі: 55% базальная сярэдняя + 40% бычынай сыроваткі (FBS/NBS) + 5% DMSO

Жыццёвыя клеткі: 90% бычынай сыроваткі (FBS/NBS) + 10% DMSO

Аликвота Падрыхтаваны раствор криоконсервации ў 15 мл трубкі Цэнтрафугі [гняздо] і захоўвае пры тэмпературы 4 ° С для наступнага выкарыстання.

(б) Падрыхтоўка клетак, якія трэба замарозіць:

Перш чым замарожваць клеткі, выберыце клеткі з добрым станам росту і ў фазе лагарыфмічнага росту і заменіце іх свежым асяроддзем 12-24 гадзіны да замарожвання, каб падтрымліваць стан клетак.

2. Эксперыментальная працэдура

1. Назірайце за шчыльнасцю клетак, якія павінны быць замарожаныя, што складае каля 80%~ 90%. Выкарыстоўвайце піпетку для аспірацыі старой асяроддзя, дадайце стэрыльныя PBS, каб прамыць клеткі 1-2 разы, і выдаліць пакінутую асяроддзе ў культурнай абстаноўцы.

2. Дадайце адпаведную колькасць трыпсіна або стрававальнага соку, каб трыпсін трапіў у клеткі і змясціце іх у інкубатар для стрававання. Назірайце за станам клетак пад мікраскопам: цытаплазма ўцягваецца, а клеткі больш не падключаюцца да лістоў. У гэты момант дадайце стоп -раствор, каб спыніць працэс стрававання.

3. Акуратна бурбайце клеткі наканечнікам, утвараючы клеткавую завісь і цэнтрыфугуйце клеткавую завісь пры 1000 абаротаў на працягу 3-5 хвілін.

Адкіньце супернатант, дадайце адпаведную колькасць замярзання і акуратна піпеткі, каб клеткі былі раўнамерна разлічаны. Адрэгулюйце шчыльнасць клетак з дапамогай криоконсереаванной асяроддзя, каб зрабіць канчатковую шчыльнасць 5 × 106/мл ~ 1 × 107/мл.

4. Выкарыстоўвайце піпетку для аддзялення криогенных труб у залежнасці ад чаканай ёмістасці, і выкарыстоўвайце аўтаматычную машыну для абмежавання, каб закрыць і запячатаць.

5. Стандартная праграма криоконсервации ўяўляе сабой хуткасць астуджэння ад -1 ° С да -2 ° С/мін, а клеткі, якія трэба замарожваць, могуць паступова замарожвацца ў адпаведнасці з наступнымі крокамі: пакаёвая тэмпература → 4 ° С (20 хвілін) → - - 20 ° С (30 мін) → -80 ° С (на працягу ночы) → доўгатэрміновае захоўванне ў вадкім азоце.

Ён таксама можа захоўвацца непасрэдна ў маразільнай камеры пры -80 ° С на працягу ночы, а затым перанесены ў вадкі азот для захоўвання.

Yongyue Medical-гэта высокатэхналагічнае прадпрыемства, якое спецыялізуецца на НДДКР, вытворчасці і продажы біямедыцынскіх расходных матэрыялаў. Парады піпеткі, піпеткі, пр. Пласціны, прадукты клеткавай культуры і іншыя біялагічныя расходныя матэрыялы. Yongyue Medical варты вашага даверу і выбару! Сардэчна запрашаем у кансультацыю!